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Fra le numerose branche in cui viene oggi suddivisa la microbiologia, quella enologica occupa un posto particolare perché è stata quella che, con i primi studi di Pasteur a metà del secolo XIX, ha rappresentato il punto di partenza per lo sviluppo di una nuova scienza la cui evoluzione è stata tale da coinvolgere ed interessare tutti i settori della biologia.
La microbiologia enologica può essere suddivisa in varie fasi, ciascuna delle quali ha riguardato un periodo di circa cinquant'anni.
LA FASE PIONIERISTICA
È quella che ha fatto seguito agli studi di Pasteur ed è consistita nella prima individuazione e definizione dei gruppi microbici che intervengono attivamente nei processi che trasformano il mosto d'uva in vino.
Questo primo periodo è durato circa fino alla fine del XIX secolo ed ha portato al reperimento dei lieviti agenti della fermentazione alcolica, alla determinazione delle trasformazioni chimiche, e ai primi tentativi di classificazione. Si tratta del periodo che qualcuno ha chiamato anche di "caccia ai microrganismi" e che ha riguardato tutti i settori della microbiologia, da quella medica a quella naturalistica.
In un primo momento, i fermenti alcolici sono stati tutti raggruppati nell'unico genere
Saccharomyces (funghi degli zuccheri) istituito nel 1870 da Rees che ha ripreso il nome proposto, ma con altro significato, da Meyen nel 1838. La specie più significativa del genere era
Saccharomyces cerevisiae, cioè il lievito tipico dei cereali (birra e pane), accanto al quale sono stati posizionati poi
Sacchnromyces ellipsoideus (tipico lievito del vino), Saccharomyces apiculatus (così chiamato per la forma delle cellule) e, via via, numerosi altri considerati differenti per l'origine, la morfologia cellulare e altri caratteri fenotipici. In questa prima fase è risultato ben chiaro che il tipo di fermento alcolico influisce in modo determinante sulla qualità del vino e che, in particolare, i
lieviti apiculati dominanti nella prima fase della fermentazione non sono idonei dal punto di vista enologico, mentre lo sono i
lieviti ellittici che intervengono nella seconda fase. Di conseguenza, già allora si è cominciato a sperimentare e mettere in atto ogni accorgimento capace di favorire lo sviluppo degli ellittici a scapito degli apiculati e si è cominciato a parlare di "lievito selezionato".
Alla fine del 1800, il periodo della caccia al microrganismo poteva considerarsi concluso perché i grandi gruppi di batteri e di lieviti erano già stati isolati e descritti e un grandissimo numero di generi e di specie di lieviti erano stati proposti o istituiti.
Il tutto era tuttavia piuttosto confuso perché per gli organismi in questione non esisteva uno schema di classificazione nel quale potessero essere inseriti; i vari tentativi di classificazione inseguivano i sempre nuovi dati acquisiti con le ricerche e non potevano essere tali da soddisfare le esigenze dei biologi.
IL MOMENTO DEL RIORDINO
Il XIX secolo ha lasciato in eredità molte cognizioni e molte notizie ma confuse e spesso in contraddizione fra di loro ed era frequente che lo stesso microrganismo fosse stato descritto e chiamato con nomi differenti. Si sentiva quindi la necessità di mettere ordine e di impostare delle classificazioni chiare ed il più possibile valide dal punto di vista scientifico. Per i batteri, la prima classificazione accettata da tutti è stata formulata da Bergey nel 1923. Alla edizione del 1923 ne hanno poi fatto seguito altre che tenevano conto di tutti gli aggiornamenti e dei risultati di nuovi e sempre più precisi criteri e metodi di classificazione.
 La prima classificazione dei lieviti che ha portato chiarezza
nel settore è stata formulata nel 1912 da Guilliermond. A questa hanno fatto seguito diverse monografie riguardanti i lieviti sporigeni ed i lieviti asporigeni ad opera degli Autori olandesi Stelling-Dekker e Lodder; il lungo e travagliato lavoro di preparazione si è poi concluso con la pubblicazione da parte di Lodder e Kreger-Van Rij della prima edizione di
"The yeasts - A taxonomic study" nel 1952. Anche questo testo fondamentale ha avuto un seguito, con la pubblicazione di nuove ed aggiornate edizioni fino alla più recente, la quarta, del 1998, curata da Kurtzman e Fell.
Dal punto di vista più strettamente enologico, nel secondo periodo sono stati individuati tutti i lieviti che intervengono o possono intervenire nel corso della vinificazione e, a ciascuna specie, è stato attribuito il ruolo svolto, primario o minoritario. Questo lavoro è stato compiuto prendendo in esame
numerosi territori vitivinicoli e identificando le specie presenti all'inizio (nel mosto), a metà ed alla fine della fermentazione alcolica. La sperimentazione ha confermato la già nota alternanza fra i gruppi di lieviti che intervengono nelle varie fasi della vinificazione ed ha evidenziato interessanti differenze a livello di specie e di ceppo in funzione di diversi fattori (vedi tab. 1).
Questa fase ha impegnato diversi studiosi (de Rossi, Castelli, Verona, Florenzano ed altri) e si è conclusa con la pubblicazione di un articolo di Castelli (1954) nel quale l'Autore ha riassunto in modo chiaro e sintetico i risultati delle ricerche eseguite, proprie e di altri.
Al termine della seconda fase, i fenomeni che avvengono nel corso della fermentazione alcolica naturale dei mosti erano tutti noti e l'opportunità di fare uso di colture di
Saccharomyces cerevisiae era ben percepita nel mondo operativo. Il concetto di lievito selezionato si è esteso dalla specie al ceppo e alcuni caratteri di primaria importanza enologica sono stati individuati: fra questi vanno ricordate la capacità di tollerare le alte concentrazioni di etanolo (il potere fermentativo, secondo Castelli), di anidride solforosa, e la capacità di produrre le più basse quantità di acido acetico. Ancora senza risposta erano i quesiti riguardanti i motivi per i quali i vini prodotti da differenti ceppi fossero di differente qualità e quale fosse l'azione svolta dal ceppo sulla composizione chimica dei vini.
SELEZIONE E MIGLIORAMENTO GENETICO
Nella seconda metà del XX secolo, anche a seguito dell'introduzione di nuovi e
sofisticati strumenti di analisi chimica, è stato possibile eseguire la
caratterizzazione dei lieviti sulla base di dati certi e, quindi, dare inizio alla selezione. Va
premesso che, anche nel caso dei lieviti, così come per tutti gli altri organismi di interesse agronomico o zootecnico, la selezione viene condotta
solamente su caratteri: qualunque altro criterio che prescinda dai caratteri è deviante. Va inoltre precisato che nel caso dei
lieviti per enologia è stata presa in esame soltanto la specie Saccharomyces
cerevisiae. Come mostrato in tabella 2, i caratteri enologici di S. cerevisiae sono stati suddivisi in due gruppi (Giudici e Zambonelli, 1992).
- Caratteri tecnologici. Sono quelli la cui presenza assicura il buon andamento della
fermentazione alcolica e permettono di programmarla e di controllarla.
- Caratteri di qualità. Sono quelli che agiscono sulla
composizione chimica dei vini nei riguardi dei composti principali o minoritari e quindi
influiscono sulla qualità del prodotto.
In Saccharomyces cerevisiae, la selezione si svolge per tappe.
- Isolamento, identificazione e collezionamento di un grande numero di ceppi sicuramente riferibili a
S. cerevisiae. I criteri ed i metodi per lo svolgimento di questa parte della
selezione sono quelli proposti da Castelli. Una parte delicata di questa prima tappa è la scelta dei materiali da cui eseguire gli isolamenti: potrebbe essere
opportuno scegliere vitigni situati in territori che danno vini
pregiati, nella presunzione che al conferimento della grande qualità concorrano anche i lieviti presenti (i cosiddetti
lieviti autoctoni). Certamente è necessario collezionare un grande
numero di ceppi sicuramente differenti fra di loro, evitando i doppioni (ceppi provenienti dallo stesso clone originale).
- Studi biometrici nell'ambito dei ceppi di S. cerevisiae
provenienti da vino. Questi studi vengono eseguiti con ceppi scelti a caso fra quelli
collezionati ed in numero tale, generalmente 100, da essere
sufficientemente rappresentativi e da consentire la simultaneità delle sperimentazioni e delle analisi. La biometria serve per
determinare:
i) la frequenza con la quale un carattere unigenico si manifesta; esempi: la
flocculazione, il potere schiumogeno, l'incapacità di produrre idrogeno solforato;
ii) i livelli medi ed i limiti estremi entro i quali si manifestano i caratteri
quantitativi; esempi: l'entità di produzione di acido acetico, di
glicerolo, di alcoli superiori ecc.;
iii) i comportamenti nei riguardi delle "performances";
esempi: l'energia di fermentazione, la resistenza all'anidride
solforosa.
Queste determinazioni vanno ripetute molte volte ed i risultati devono essere
statisticamente significativi; alla fine, per ogni carattere vengono scelti i ceppi di riferimento che vengono poi usati per prove comparative con ceppi di
nuovo isolamento.
- Selezione clonale, in parte coincidente con le fasi
precedenti. Consiste nel ricercare, fra i lieviti agenti di
fermentazioni naturali, ceppi in possesso di ottimi caratteri ed in
combinazioni interessanti. I ceppi di nuovo isolamento vanno confrontati con quelli di
riferimento individuati con gli studi biometrici.
- Miglioramento genetico. Di ogni carattere vanno individuati, oltre che i valori medi ed estremi o la frequenza, la
ereditarietà, cioè la modalità di trasmissione ai discendenti per riproduzione sessuale. Il
miglioramento genetico con metodi classici consiste nell'esecuzione di incroci fra ceppi in possesso di differenti caratteri in modo da ottenere nuove
colture dotate di un complesso di ottime prerogative enologiche.
I risultati ottenuti con la selezione di S. cerevisiae possono essere considerati molto buoni; sono stati trovati od ottenuti
diversi ceppi dotati di caratteristiche enologicamente positivi e privi di difetti. I risultati,
tuttavia, non sono stati così clamorosamente interessanti come ipotizzato da Winge nel 1939 quando, dopo aver messo a punto i metodi per lo studio della genetica dei lieviti (e, quindi, del miglioramento
genetico), dichiarava: "Ditemi che cosa deve saper fare un ottimo lievito per enologia o per birrificio ed io ve lo
costruisco". Il fatto è che con i metodi di selezione classici (clonale o miglioramento genetico) si gioca con i caratteri della
specie e dentro i livelli o secondo la frequenza con cui essi si
manifestano; non è possibile pretendere che un ceppo di Sacchuromyces cerevisiae abbia delle attività o delle
prerogative che sono estranee alla specie.
Nello stesso periodo, circa agli inizi degli anni '70, si è verificato un altro evento che ha
segnato una svolta importante nell'uso dei lieviti selezionati in enologia: la comparsa in commercio dei
lieviti allo stato secco (lieviti essiccati o lieviti disidratati, o lieviti secchi attivi =
Lsa). In Italia, il lievito per panificazione è tradizionalmente prodotto e
commercializzato allo stato umido (lievito pressato, con circa il 75% di umidità); il lievito essiccato (con umidità inferiore al 10%), molto comune negli Usa,
veniva prodotto soltanto in piccole quantità e per usi particolari. La immissione in commercio
di una confezione di lievito essiccato per enologia ha destato immediatamente l'interesse del mondo enologico. Ai primi preparati, la cui effettiva
idoneità sollevava molti dubbi, ne sono seguiti molti altri con più precise indicazioni sulle
origini del ceppo e sulle sue più importanti caratteristiche
enologiche. I lieviti disidratati hanno rappresentato un mezzo efficace per la diffusione e l'impiego delle colture selezionate. Non si può, tuttavia, fare a meno di rilevare che tutti i preparati
disponibili all'inizio dell'anno 2000 erano rappresentati da ceppi ottenuti con selezione clonale.
I LIEVITI DEL FUTURO
Con i migliori ceppi selezionati di Saccharomvces cerevisiae si ottengono fermentazioni
alcoliche molto regolari e pulite e vini privi di difetti; per ogni applicazione enologica sono disponibili colture dotate di
alcune caratteristiche particolari quali: il tipo di sviluppo,
flocculento (per spumantizzazione in bottiglia) o a cellule disperse; una discreta azione
demolitrice sull'acido malico (per vinificazione in rosso); la capacità o l'incapacità di produrre composti solforati.
Resta tuttavia il fatto che i ceppi privi di caratteri negativi sono molto simili fra di loro. Proprio per questo motivo, alcuni enologi hanno espresso l'opinione che con l'impiego anche dei
migliori ceppi selezionati di S. cerevisiae si abbia un
appiattimento della qualità dei vini perché si perdono le
caratteristiche di tipicità; questo a scapito, soprattutto, dei vini di grande pregio.
Ci sono invece altri lieviti, diversi da S. cerevisiae e del tutto privi di idoneità enologica, che sono in possesso di caratteri (anche di un solo carattere) che potrebbero contribuire al
conferimento della qualità e della tipicità dei vini. Le ricerche oggi in atto sono finalizzate
allo studio della possibilità di fare esprimere questi caratteri nel corso della fermentazione
alcolica dei mosti; gli studi in oggetto sono cominciati verso la fine del XX secolo, sono
attualmente in pieno svolgimento e, probabilmente, costituiranno le basi della
microbiologia enologica del futuro. Questi metodi di selezione, non sempre nuovi in assoluto, sono i seguenti.
- Ottenimento di ibridi interspecifici. Alcune specie del genere
Saccharomyces possiedono delle caratteristiche enologiche del tutto differenti da quelle di
S. cerevisiae ma non sono altrettanto valide. Con S.
cerevisiae, esse hanno un sufficiente grado di affinità genetica per dare origine ad ibridi
interspecifici e sterili. Negli ibridi, i caratteri dei genitori si
presentano in nuove e talvolta molto interessanti combinazioni.
- Trasferimento in S. cerevisiae di caratteri di altre specie mediante l'ingegneria
genetica. Si tratta di una applicazione della metodologia del Dna
ricombinante mediante la quale si ottengono lieviti facenti parte del gruppo degli Organismi geneticamente modificati
(Ogm).
- Impiego per la fermentazione dei mosti di più specie di lieviti
selezionati. L'idea di affidare la fermentazione dei mosti a differenti specie di lieviti in successione non è nuova: si tratta delle cosiddette
fermentazioni scalari, una delle quali, quella naturale, avviene con la successione: apiculati
--> ellittici. Verona e poi Castelli, già negli anni '40, hanno proposto per la prima fase fermentativa alcune specie dei generi
Zygosaccharomyces e Torulaspora che conferiscono ai vini ottima qualità. Recentemente le
sperimentazione sulle fermentazioni scalari o con lieviti in
associazione sono state riprese con l'intento di conferire ai vini anche quelle caratteristiche di qualità impartite da lieviti
altrimenti sopraffatti da S. cerevisiae.
- Studio dei lieviti autoctoni. La ricerca si basa sull'ipotesi che al conferimento della
qualità di certi vini pregiati concorrano i lieviti selezionati
dall'ambiente (in senso lato). L'individuazione di ceppi non solo di S. cerevisiae ma anche di altre specie minori potrebbe permettere di ricostruire
quanto avviene nelle fermentazioni naturali e potrebbe porre le basi per una razionale
fermentazione scalare o in associazione.
Si tratta di argomenti di ricerca di grande interesse il cui sviluppo futuro è di difficile
previsione; essi meritano certamente di essere tenuti in grande considerazione.
MICLOFLORA
DELLUVA
Pasteur per primo e successivamente altri studiosi, rivelarono il parallelismo esistente tra processo di maturazione dell'uva e comparsa alla superficie degli acini e del raspo di una abbondante microflora. Fu così posto il problema dell'origine e della trasmissione da un anno all'altro della cosiddetta
microflora epifitica dell'uva. All'atto della raccolta dell'uva alcuni acini stramaturi si staccano dal grappolo e cadono sul terreno; inoltre qualche grappolo viene lasciato sul tralcio.
Sia gli acini caduti che quelli rimasti con i grappoli sulla vite costituiscono il substrato zuccherino per lieviti che, penetrati nell'interno attraverso lesioni della buccia prolificano e quindi esaurito lo zucchero sporificano.
Sotto forma di spore i lieviti trascorrono nel terreno la stagione invernale e quella primaverile. Nel terreno dei vigneti si trovano lieviti fino alla profondità di 20-30 cm; in queste condizioni come spore, possono sopravvivere per 3 anni ed anche più. In estate con la maturazione le spore riprendono il loro ciclo vegetativo;
trasportate dal vento, inglobate in particelle di terreno e dagli insetti, specie dalle vespe le spore vengono trasportate sugli acini.
Le spore quando trovano le condizioni favorevoli germinano e si moltiplicano. Diversi fattori concorrono a far variare, sia qualitativamente che
quantitativamente la microflora delle uve:
- precipitazioni atmosferiche: le piogge nel periodo antecedente la vendemmia dilavano i grappoli impoverendoli dei lieviti;
- prolungata siccità;
- intense radiazioni solari;
- stato sanitario delle uve.
I lieviti e gli altri microrganismi che si riscontrano sulle uve all'epoca della vendemmia si possono considerare adattati mediante lunga selezione all'ambiente ed ai tipi di materia prima e di prodotti conseguibili in quel determinato ambiente. La microflora delle uve quindi, è rappresentata da lieviti e da altri microrganismi appartenenti a classi e generi diversi. Questi microrganismi con la pigiatura passano nel mosto.
Ai fini enologici i microrganismi presenti sulle uve possono essere distinti:
1) Schizomiceti o batteri: Sono dei (vegetali) microscopici unicellulari senza clorofilla che si moltiplicano dividendosi in due (da cui il nome di Schizomiceti) e le cui dimensioni sono
dell'ordine del millesimo di millimetro (micron - µm). Sono presenti sulle uve e in gran numero e con estrema varietà di caratteri fisiologici, non tutti però hanno interesse in enologia, ma solo quelli in grado di riprodursi e sopravvivere al pH del mosto (2,8-3,8). Ad eccezione della fermentazione malolattica tutti gli altri batteri costituiscono un pericolo permanente per la
conservazione dei vini. Appartengono al gruppo degli Schizomiceti i batteri acetici e i batteri lattici, i
primi sono responsabili dell'acescenza, i secondi della fermentazione malolattica e a volte della fermentazione mannitica, dello spunto e del girato.
2) Blastomiceti dotati o privi di potere fermentativo: Nel mosto di uva si trovano diverse specie di lieviti, che variano di numero e di qualità secondo il clima e le condizioni di maturazione delle uve. Tra queste specie se ne riconoscono facilmente due tipi caratteristici:
- i lieviti apiculati (cellule a forma di limone),
- i lieviti ellittici (cellule globose ovoidali).
I lieviti apiculati iniziano la fermentazione, ma producono poco alcole e quindi molti prodotti secondari; i lieviti ellittici si sviluppano a fermentazione avviata e formano molto alcole e poco acido acetico. A queste due specie se ne accompagnano altre di minore importanza, ognuno con caratteristiche fermentative.
Sono dotati di potere fermentativo: Saccharomyces,
Schizosaccharomyces, Sacchoramycoides, Kloeckera e Hansienospora. Sono privi di potere fermentativo:
Pichia membranaefaciens, Candida vini, Hansenula anomala che si moltiplicano respirando l'alcool etilico e di conseguenza diminuiscono nettamente il grado alcolico del vino. I lieviti sono esseri unicellulari come i batteri, ma di dimensioni molto più grandi e le cui cellule ovoidali o allungate misurano da 4 fino a 15 µm di diametro. Si riproducono per gemmazione, possono anche presentare la formazione di spore molto resistenti e durevoli, formate dalla coniugazione fra due diverse cellule. Si formano così nella cellula che si
trasforma in asco da 1 a 8 spore. Le spore si formano quando il lievito si trova in condizioni difficili e quando si trovano nelle condizioni favorevoli germinano e danno origine a nuove cellule vegetative.
3) Ifomiceti o muffe. Le muffe a differenza dei lieviti sono pluricellulari, costituite cioè da diverse cellule legate una all'altra a formare dei filamenti detti
ife. L'insieme di molte ife prende il nome di micelio, che ha il tipico aspetto feltroso e ovattato.
Lieviti e muffe hanno caratteri fisiologici molto simili, ma mentre i lieviti possono vivere anche in assenza di aria, le
muffe sono strettamente aerobie. Batteri, lieviti e muffe possono favorirsi o combattersi a vicenda (antibiosi). Le muffe che si possono trovare nelle uve sono diverse (es.:
Penicillium, Botrytis, ecc.). Le spore di questi eumiceti passano con la pigiatura nel mosto dove troverebbero ottime condizioni di sviluppo se non intervenisse la fermentazione; la formazione di alcole e lo sviluppo di
CO2 provocano un ambiente non idoneo alla loro riproduzione. Se la fermentazione, per una qualsiasi causa, tarda a svilupparsi, gli ifomiceti possono iniziare il processo di moltiplicazione consumando zuccheri a danno della produzione di alcool: si ritiene che fra i prodotti del loro metabolismo vi siano sostanze che inibiscono lo sviluppo dei lieviti responsabili della fermentazione alcolica.
Fonti:
Vigna e Vini 4 2004
Industria delle Bevande settembre 2000
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