Roberto Ferrarini*, Riccardo Rossini**, 
Enrico Bocca**, Sandra Torriani* 
VQ numero cinque — giugno 2mila7 pagg. 68-75

II vino è il prodotto di un complesso sistema microbiologico che evolve durante le diverse fasi tecnologiche della sua preparazione. La composizione microbiologica cambia partendo dalle fasi di raccolta, fermentazione e affinamento. In ognuna di queste fasi possono essere presenti diversi microrganismi che ne modificano la composizione con conseguenze che in alcuni casi possono essere nefaste sotto l'aspetto qualitativo. In particolare un microrganismo è sinonimo di queste alterazioni: si tratta del lievito Brettanomyces.

Esso svolge un ruolo fondamentale nella produzione delle birre belghe Lambic (denominazione protetta e regolamentata da disciplinare), ed è ritenuto il responsabile del parti-colare aroma di queste birre: la fermentazione ad opera del Brettanomyces avviene dopo 5 – 8 mesi dalla conclusione della fermentazione alcolica, poiché questo lievito riesce a sviluppare sugli zuccheri che Saccharomyces non è in grado di fermentare. Oltre ai tipici composti aromatici dal sentore di cuoio, cavallo ecc., Brettanomyces è in grado di apportare grandi quantità di esteri, al contrario del Saccharomyces, che normalmente è caratterizzato da un'attività esterasica relativamente bassa. L'affinamento e conseguenti riprese fermentative possono proseguire anche per due tre anni.
L'origine ecologica nei vini del Brettanomyces è ambigua. Il limite maggiore nell'isolamento di Brettanomyces è la scarsa capacità competitiva di questo lievito nei confronti di una microflora indigena che, nei terreni convenzionali, riesce a sviluppare molto più velocemente. Anche se la presenza sull'uva è ritenuta assai rara, è abbastanza comune l'isolamento di questo lievito in cantina. Molti ricercatori hanno evidenziato la possibilità di isolare Brettanomyces in mosti in fermentazione in Francia, in Germania, in Italia, in Sud Africa. Uzbekistan, Nuova Zelanda, Spagna. Nostre esperienze (dati non pubblicati) hanno messo in evidenza la presenza di Brettanomyces in mosti con arresti fermentativi.
La quantità di pubblicazioni (tecniche e scientifiche) sull'argomento è di circa 111 comunicazioni su riviste (Ricerca su Vitis Vea, aprile 2007) edite soprattutto fra il 2002 e 2004. Anche se attualmente l'interesse in tal senso sembra notevolmente ridimensionato, ciò non significa che l'argomento sia stato completamente esaurito e tanto meno che il problema sia stato superato.

Cenni storici
Il termine Brettanomyces venne introdotta nel 1904 da Claussen per identificare un lievito responsabile del caratteristico aroma di alcune birre inglesi del tempo (da cui il prefisso Brettano). Claussen infatti identificò un ceppo di lievito non appartenente al genere Saccharomyces agente di una fermentazione secondaria della birra. I primi studi sistematici furono condotti da Custers (1940); il genere è stato studiato e definito su 17 ceppi isolati prevalentemente dall'industria della birra. L'unico ceppo studiato proveniente dall'ambiente enologico fu isolato da Krumbholz nel 1930 in un vino francese. Le specie attualmente riconosciute sono: Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus e Brettanomyces naardeensis.

Brettanomyces a confronto con altri microrganismi
Contrariamente al Saccharomyces, il Brettanomyces possiede una parete cellulare resistente all'azione della beta-glucanasi. Questo micete è caratterizzato da ciclo vitale breve e da crescita lenta, accompagnata da una bassa produzione di anidride carbonica. Rispetto ad altri lieviti, esso risulta resistente alla cicloesimide (actidione).
Una delle peculiari caratteristiche fisiologiche del Brettanomyces è la produzione di fenoli volatili (4-vinilfenolo e 4-vinilguaiacolo) a partire da due acidi cinnamici (acido p-cumarico e acido ferulico).
Quindi Brettanomyces possiede attivià cinnamil esterasica, decarbossilasica e, diversamente dal Saccharomyces, vinilreduttasica; marcata è anche la sua azione esterasica e b-glucosidasica.
Inoltre, nel corso del suo sviluppo può produrre altri cataboliti (acido isovalerico, tetraidropiridine e altri) che possono svolgere un ruolo importante sulle caratteristiche sensoriali del prodotto.
Anche Oenococcus oeni può produrre etilfenoli ma a concentrazioni decisamente inferiori a quelle del Brettanomyces; tali composti, pertanto, sono dei traccianti dello sviluppo di questo lievito.
Il Brettanomyces può essere considerato tra i maggiori produttori di ammine biogene. Il tenore medio di ammine biogene totali, rilevato in presenza di Brettanomyces bruxellensis, è di circa 15 mg/L.
La difficoltà nel recupero delle cellule ha determinato sempre una certa difficoltà nell'analisi microbiologica. Lo sviluppo nel 2002 di un terreno selettivo denominato Bio DB ha permesso la valutazione epidemiologica di Brettanomyces. Il terreno Bio DB agar (Enologica Vason – Italia), confrontato con altri (EM, YNB, Wld, Agar Lisina) è risultato il più selettivo nella ricerca di Brettanomyces.

Come e quando si sviluppa?
I fattori che possono condizionare lo sviluppo di Brettanomyces sono: ossigeno, anidride solforosa, pH, zuccheri, etanolo, acido acetico, temperatura, competizione con il Saccharomyces, fattori di sopravvivenza.

n Ossigeno
L'ossigeno stimola lo sviluppo di Brettanomyces e la sua produzione di etilfenoli, in particolare di 4-etilfenolo. Livelli di O₂ superiori a 7 mg/L (corrispondenti a una saturazione di circa l' 80%) stimolano la crescita di B. bruxellensis, come evidenziato nel grafico 1.
Nei vini rossi con livelli di ossigeno minori del 2% di saturazione è stata osservata una riduzione sia della crescita sia della produzione di etilfenolo nel tempo. La crescita del lievito segue l'andamento di una curva a campana con una fase lag iniziale. La produzione di 4-etilfenoli inizia durante la fase esponenziale. Quando viene raggiunta la concentrazione massima cellulare, metà della quantità totale di 4-etilfenolo è già stata prodotta. La rimanente parte di 4-etilfenolo viene prodotta all'inizio della fase iniziale di letalità.
La presenza di ossigeno stimola la produzione di acido acetico con conseguente aumento dell'acidità volatile del vino.

n Anidride solforosa e pH
La crescita di Brettanomyces risulta inibita a pH 3,5 se la concentrazione di anidride solforosa libera è superiore ad almeno 20 mg/L, corrispondenti a 0,4 mg/L di anidride solforosa molecolare. Recenti studi hanno però evidenziato che l'anidride solforosa può indurre in Brettanomyces lo stato VNBC (Viable But Not Culturable). Da queste evidenze l'anidride solforosa, se utilizzata a dosi superiori a 0,4 mg/L di molecolare, deve essere considerata uno strumento per l'inibizione dello sviluppo di questo lievito, ma non un antisettico in grado di impedirne con certezza la sua presenza nel mezzo. Allo stesso modo pH inferiori a 3,19 inibiscono la crescita di Brettanomyces.

n Zuccheri
II Brettanomyces, oltre a glucosio e fruttosio, è in grado di metabolizzare altri zuccheri come i pentosi, non utilizzati dal Saccharomyces durante la fermentazione alcolica, il cellobiosio, uno zucchero prodotto durante le fasi di tostatura delle barrique, il trealosio, disaccaride presente nella cellula dei lieviti. Inoltre è in grado di utilizzare come fonte carboniosa anche il glicerolo.
Questo microrganismo riesce a moltiplicarsi fermentando anche piccole quantità di zuccheri residui nel vino: anche la fermentazione di soli 300 ng/L di zuccheri è sufficiente per produrre una popolazione di oltre 3000 cellule/mL, popolazione sufficiente per formare etilfenoli oltre la soglia di percezione olfattiva.
Il metabolismo del Brettanomyces è di tipo Custer, quindi la fermentazione può avvenire solo in presenza di ossigeno. La contemporanea presenza di ossigeno e zuccheri determina la produzione di grandi quantità di acido acetico da glucosio.

n Etanolo
Secondo esperienze di Ferreira (2001) la crescita di Brettanomyces risulta inibita dalla presenza di etanolo oltre l'11% (grafico 2); nello stesso grafico, si evidenzia come la produzione di etilfenolo inizi nella fase stazionaria di crescita. Tuttavia, in nostre esperienze, sono stati riscontrati con buona frequenza la presenza di Brettanomyces ed etilfenoli in quantità elevata anche in vini a elevato tenore alcolico, come ad esempio i vini Amarone.

n Acido acetico
Brettanomyces risente della presenza nel mezzo colturale di concentrazioni superiori ai 2 g/L di acido acetico. Questa inibizione è maggiore in condizioni aerobiche che anaerobiche; comunque il Brettanomyces risulta assai meno sensibile del Saccharomyces.

n Temperatura
La produzione di 4-etilfenolo da parte del Brettanomyces a due diverse temperature di incubazione (16° e 30 °C) in un mezzo con etanolo come unica fonte di carbonio è mostrata nel grafico 3. Durante la fase di latenza, l'acido p-cumarico è convertito a 4-vinilfenolo, che viene successivamente ridotto a 4-etilfenolo fino alla fine della fase esponenziale. La temperatura più bassa di crescita riduce la velocità di produzione del fenolo volatile. Questi risultati sono stati confermati anche utilizzando il glucosio come altra fonte di carbonio. 
Lo svantaggio dell'uso delle basse temperature durante la fase di affinamento consiste nella riduzione della velocità di polimerizzazione dei composti fenolici, la riduzione dell'evaporazione e della concentrazione del vino, lo sviluppo lento della maturità del vino stesso.

n Competizione con Saccharomyces cerevisiae
Delia (1997) ha dimostrato come in colture batch l'inoculo di Brettanomyces in presenza di Saccharomyces cerevisiae determini un ulteriore fattore limitante per il primo, anche quando l'inoculo di Brettanomyces avviene in concentrazione notevolmente superiore. Il Brettanomyces riesce a inibire la crescita di Saccharomyces solo nel caso in cui il primo abbia superato la fase lag di crescita.

n Fattori di sopravvivenza
Gaunt et al. (1988) hanno dimostrato che l'aggiunta di 1 mM Mg⁺⁺, NH₄⁺, K⁺ e PO₄^3-, da soli o in combinazione a una sospensione di B. anomalus, non hanno effetto sulla cinetica della glicolisi. D'altra parte Rose e Harrison (1971) dimostrarono che la pirridossina è l'unica vitamina ad avere un effetto positivo sulla crescita del Brettanomyces.
Guadalupe Aguilar Uscanga et al. (2000) in uno studio per la determinazione degli elementi essenziali del mezzo di coltura ideale per la crescita di Brettanomyces, hanno misurato l'effetto limitante di ciascun componente sulla base della crescita, della produzione di etanolo e del consumo di glucosio. B. bruxellensis è poco esigente dal punto di vista nutrizionale nei confrontati del S. cerevisiae. Gli ioni magnesio e fosfato non si sono dimostrati essenziali per la sua crescita; la loro concentrazione (34 mg/L di potassio e 0,7 mg/L di magnesio) nell'estratto di lievito sembra essere adeguata per soddisfare le sue esigenze nutrizionali. L'ammonio solfato e l'estratto di lievito hanno una marcata influenza sulla crescita e sull'attività fermentativa. B. bruxellensis sembra essere sensibile all'ammonio solfato quando supera concentrazioni di 2 g/L. L'estratto di lievito è il componente più importante per la crescita del microrganismo; inoltre la sua morfologia risulta sensibile ai cambiamenti nutrizionali.
Le cellule di B. bruxellensis sono eccezionalmente resistenti a restrizioni nutrizionali, abilità che può incrementare le sue possibilità di sviluppo anche nel corso di lunghi periodi di stoccaggio qualora, le condizioni ambientali diventino favorevoli.

Fenoli volatili: davvero così sgradevoli?
Lo sviluppo di Brettanomyces nei vini è associato alla comparsa di sentori fenolici, alla perdita di aromi fruttati e allo sviluppo di sentori diversamente descritti come sentori di fattoria, sudore di cavallo, medicinale, pelle animale, cuoio, plastica, cerotto, vegetale, terroso.

A tal proposito molta importanza viene data alla presenza dei due fenoli volatili prodotti dal Brettanomyces. Tuttavia la letteratura non sempre riporta dati concordanti per quanto concerne le loro soglie di preferenza e percezione sensoriale.
Va inoltre sottolineato che alcuni ricercatori ipotizzano l'effetto sinergico di altre specie microbiche (Pichia guillemondii) nel corso dell'alterazione dei vini ad opera del Brettanomyces. Appare evidente quindi che l'intervento del Brettanomyces porta a una modifica del quadro sensoriale, ma in maniera e misura spesso diverse, con effetti sulla qualità del prodotto non sempre apprezzabili agevolmente e in modo univoco; tant'è che anche autorevoli esperti hanno assunto sull'argomento una posizione meno draconiana, come nel caso di Jeff Morgan, wine educator e primo editore della West Coast di Wine Spectator, che definisce il problema dei vini Brett come una fobia tipicamente americana.
Ma non mancano anche gli esempi di aziende prestigiose i cui vini risultano sovente affetti da Brett il cui carattere viene accettato come elemento di tipicità: Chateau Beaucastel (Valle del Rodano – F), Domaine Tempier (Provenza – F), Chàteau Dominus (Valle del Napa – US).

Emblematico il caso di una degustazione condotta alla Cornell University con tecnici ed esperti di alcuni vini, fra cui Chàteau Pichon Longueville Comtess de Lalande 1989, descritto come "classico Bordeaux, poco fruttato, complesso, con sfumature di legno bruciato e bagnato, sentori di fattoria sebbene attraente". La presenza di 4-etilfenolo era di ben 15.800 ppb e sulla rivista Wine Spectator questo vino è stato valutato con 92 punti; lo stesso Cru, ma dell'annata 1998, in una degustazione condotta dalla sezione Veneto Occidentale dell'Associazione Enologi Italiani non era stato valutato, nonostante l'elevato tenore di 4-etilfenolo (2642 ppp), palesemente alterato. Nelle medesima occasione sono stati degustati altri vini rossi di alta gamma, alcuni dei quali erano caratterizzati da tenori in fenoli volatili eccedenti la soglia di accettabilità indicata da Chatonnet, ma comunque valutati positivamente praticamente dalla generalità dei tecnici presenti (tabella 1).

I motivi della diffusione
L'ultimo decennio ha visto un notevole incremento della diffusione del problema a causa dell'effetto sinergico di vari fattori:
n 1) Aumento del pH dei vini (il Brettanomyces è fortemente sensibile a questo fattore): le maturazioni delle uve più accentuate per le condizioni climatiche più favorevoli e il diffondersi della tendenza di elaborare vini con maggior struttura e concentrazione, hanno causato un consistente aumento del pH dei vini e in particolare di quelli rossi.
n 2) Diminuzione delle operazioni di filtrazioni e di chiarifica.
Noi stessi abbiamo isolato il Brettanomyces nel corso di un'esperienza di microssigenazione condotta in recipiente di acciaio in una realtà di cantina dove le operazioni di pulizia e sanitizzazione erano condotte con la massima cura.

Prevenzione e cura
Se l'alterazione da Brettanomyces è poco pronunciata, è possibile mascherarla con tagli con altri prodotti e/o con opportune chiarifiche.
Tuttavia se questo lievito si è sviluppato provocando una consistente alterazione del prodotto, gli interventi curativi risultano di scarsa efficacia: infatti non esistono coadiuvanti enologici attualmente consentiti dal legislatore in grado di rimuovere in maniera selettiva i fenoli volatili o comunque l'off-flavor prodotto da questo microrganismo. I carboni adsorbenti, anche a dosi di 100 g/hL, rimuovono percentuali limitate di 4EF: per contro alcuni polimeri di sintesi sono in grado di rimuovere dal mezzo gli etil fenoli ma, oltre ai limiti legali per il loro impiego, essi agiscono in maniera eccessivamente invasiva su altri componenti di pregio del vino.
Per contro, operando l'adsorbimento dei fenoli presenti nel permeato di nanofiltrazione del vino alterato e procedendo alla reintegrazione nel prodotto di partenza del liquido così trattato, il carattere Brett può essere rimosso con successo; tuttavia questa pratica, oltre che costosa e complessa, non è attualmente consentita nei Paesi europei.
Evidente pertanto l'importanza dell' azione preventiva nei confronti di questo inquinante microbico. In tal senso è strategica un'accurata igiene di cantina e in particolare dei vasi vinari in legno, spesso - ma non sempre - causa del diffondersi dell'inquinamento da Brettanomyces.

La sanitizzazione di barrique e botti non è certo un intervento agevole: bisogna prevedere un accurato lavaggio del recipiente. Efficace in tal senso, anche per la sua discreta azione sanitizzante, l'impiego del permanganato di potassio, nonché l'uso di potenti antisettici (combustione dello zolfo, acido peracetico). Altre tecniche, come il trattamento con microonde o con acqua ozonizzata, si sono dimostrate di una certa efficacia ma, dato che il loro impiego è tutt'altro che agevole, al momento non hanno trovato applicazione in cantina.
Per quanto concerne il controllo dello sviluppo di Brettanomyces sul vino, l'anidride solforosa risulta efficace se il suo livello di molecolare risulta di almeno 0,4 mg/L (20 mg/L di libera a pH 3,5); nei casi di vini inquinati, meglio arrivare a 0,8 mg/L. Sono stati inoltre valutati altri antisettici: l'acido sorbico è risultato inefficace alle dosi usuali di impiego, la pimaricina (peraltro non consentita in enologia) ha dato risulti contrastanti in merito alla sua efficacia. II dimetildicarbonato (oggi consentito solo in fase di imbottigliamento) si è dimostrato efficace in dosaggi inferiori a 50 mg/L.

La filtrazione risulta senza dubbio un mezzo efficace nell'abbattimento della carica microbica, tuttavia può risultare un intervento in contrasto con l'impostazione di determinati stili di vino.
Senza dubbio assai efficace come misura preventiva risulta il monitoraggio dell'eventuale presenza dell'inquinante microbico con l'utilizzo di terreni altamente specifici e selettivi (Bio DB - Enologica Vason, Italia): se la presenza di Brettanomyces viene segnalata durante la sua fase moltiplicativa è possibile, visto il suo lento sviluppo e dato che la produzione dei fenoli volati avviene successivamente alla moltiplicazione del lievito, evitare l'alterazione sensoriale.
L'analisi chimica degli etilfenoli è consigliabile per monitorare lo stato di inquinamento della cantina e per suggerire eventuali strategie più severe nei confronti del Brettanomyces al verificarsi di dati analitici di 4-EF superiori ai 400 ppb. Va comunque sottolineato che l'analisi degli etilfenoli mette in evidenza l'operato ma non la presenza di cellule vitali di Brettanomyces.
In conclusione, il successo della prevenzione dagli effetti nefasti del Brettanomyces non si basa su qualche specifica procedura, bensì su una serie di precisi e puntuali interventi e attenzioni. 

La Biliografia può essere richiesta all'indirizzo enrico.bocca@vason.it

Roberto Ferrarini*, Riccardo Rossini**, 
Enrico Bocca**, Sandra Torriani* 
* Dipartimento di Scienze, Tecnologie, Mercati della Vite e del Vino - Università degli Studi di Verona - S. Floriano (VR) 
** Enologica Vason - Pedemonte (VR)

VQ numero cinque — giugno 2mila7 pagg. 68-75

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